Técnicas de la ingeniería genética 01

• Técnicas de ingeniería genética, por Lourdes Luengo del IES La Rábida (Huelva)
• Las ideas pincipales

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PREGUNTAS PARA COMPRENDER LOS VÍDEOS Y ANIMACIONES



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Las ENZIMAS DE RESTRICCIÓN son enzimas que cortan el ADN en secuencias específicas de nucleótidos, La secuencia reconocida tiene normalmente una longitud de cuatro a seis nucleótidos. Por ejemplo la enzima de restricción EcoR1 reconoce la secuencia GAATTC. Las dos semicadenas de ADN tienen la misma secuencia reconocible pero en sentidos opuestos. Puesto que la secuencia de reconocimiento está presente en ambas semicadenas, la endonucleasa de restricción puede unirse y cortar ambas semicadenas. Como el punto de corte frecuentemente no está en el centro de la secuencia de reconocimiento las cadenas de ADN son antiaparalelas los extremos del corte no coinciden a la misma altura; después del corte cada semicadena de ADN tiene un extemo como semicadena sencilla de unos pocos nucleótidos y ambos extremos son complementarios entre sí; es a lo que se llama "extemos cohesivos o pegajosos" LO QUE HACE A LOS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN TAN VALIOSOS ES QUE SIEMPRE CORTAN IGUAL Y LOS FRAGMENTOS PRODUCIDOS POR UNA CIERTA ENZIMA -procedentes, por ejemplo, de dos células distintas- PUEDEN UNIRSE ENTRE SÍ. SON HERRAMIENTAS FUNDAMENTALES EN LA INGENIERÍA GENÉTICA

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El primer paso para clonar un gen (clonar = copiarlo numerosas veces dentro de otro organismo) es aislar el gen deseado desde el organismo que lo contiene.

El ADN se aisla y después se fragmenta con enzimas de restricción. Los enzimas de restricción que se usan en clonación producen cortes en secuencias específicas del ADN, generando fragmentos con extremos cohesivos o pegajosos. Cada fragmento tiene una secuencia de nucleótidos de cadena sencilla en sus extremos que es capaz de hibridar con ADN que haya sido fragmentado con el mismo enzima de restricción. Los fragmentos de ADN se incorporan entonces a plásmidos. Los tipos de plásmidos usados en clonación tienen un único sitio de corte para el enzima de restricción y cuando es cortado por el enzima de restricción genera el mismo tipo de extremos cohesivos que hay en los fragmentos de ADN que van a ser clonados. Los extemos cohesivos del plásmido y del fragmento de ADN a clonar se aproximan y el enzima ligasa produce la unión definitiva. El siguiente paso es incorporar el plásmido a bacterias hospedadoras (es la trasnformación bacteriana y espontáneamente las bacterias absorben plásmidos libres que haya en su entorno). Cada célula contiene un fragmento diferente del ADN original del organismo. Todos estos tipos bacterianos representan en conjunto una biblioteca de ADN. Las células pueden ser, ahora, sembradas sobre un medio se cultivo gelatinoso (agar). La colonia de células que contiene el ADN deseado debe ser ahora identificada y aislada.

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Uno de los primeros experimentos en ingeniería genética fue dirigido por Stanley Cohen y Herbert Boyer en 1973. Demostraron que el gen del ARN ribosómico de rana podía ser transferido y expresarse en células bacterianas. El primer paso fue construir el plásmido vector llamado pSC101. Este vector artificial contenía un único lugar para el enzima de restricción EcoR1 y un gen para la resistencia al antibiótico tetraciclina.

Se utilizó el enzima de restricción EcoR1 para cortar el ADN de la rana en pequeños fragmentos. Después los fragmentos de ADN se mezclaron con el plásmido vector que había sido cortado con el mismo enzima de restricción EcoR1. Los extremos pegajosos o cohesivos del ADN se asocian y se unen gracias a la ADN ligasa. Algunos plásmidos incorporan otros genes de la rana distintos del gen para ARNr y algunos plásmidos ni siquiera incorporan fragmentos de ADN de la rana. Los plásmidos son transferidos a una raza -cepa- de bacteria Escherichia coli sensible a la tetraciclina y estas bacterias son sembradas en un medio de cultivo que contiene tetraciclina. Las células que han incorporado el plásmido portador del gen de la tetraciclina crecen y forman colonias de celulas. Algunas de esas colonias están formadas por células que portan el gen del ARNr de la rana. Los investigadores comprueban la presencia del gen del ARNr de la rana en las colonias que han crecido

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Hay diversas maneras de fabricar vacunas. Tradicionalmente, las vacunas han consistido en patógenos muertos o inactivos. Un segundo enfoque tradicional es usar una cepa (variante) atenuada del patógeno. Durante la atenuación, el patógeno pierde su virulencia, pero retiene muchos de sus antígenos y asi es capaz de provocar una respuesta inmune.

Las vacunas de subunidades o acelulares consisten en componentes seleccionados del patógeno como por ejemplo una estructura superfical, una macromolécula interna o el flagelo. -Son más seguras puesto que no se utiliza el organismo completo y por lo tanto no hay riesgo de una defectuosa atenuación-

Las vacunas recombinantes estan producidas mediante la clonacion dentro de un microrganismo hospedador del gen de una estructura como por ejemplo una proteína de superficie de un patógeno. Por ejemplo, el gen de la proteina superficial del virus de la hepatitis B ha sido clonado en una célula de levadura. La levadura produce la proteína superficial del virus la cual puede ser purificada del medio de cultivo de la levadura y usada como una vacuna.

Ya hemos comentado sobre una dificultad que se presenta al intentar clonar un gen de células eucariontes dentro de una bacteria debido a la presencia de intrones en los genes eucariontes. 

En la mayoría de los eucariotas, los segmentos que se expresan en los genes están separados por secuencias intercaladas de nucleótidos llamadas intrones. Los intrones y los exones son transcritos por la ARN polimerasa dando lugar a un ARN mensajero inmaduro o precursor del ARNm definitivo. Después los intrones son eliminados del presursor del ARNm y los exones se unen para formar el ARNm maduro. 

El ADN de las células procariotas no contiene intrones y por lo tanto las bacterias son incapaces de eliminar los intrones del ADN eucarionte y producir ARNm funcional. Por lo tanto el ADN eucarionte no puede ser clonado directamente en células procariontes para hacer proteínas eucariontes funcionales. 

Antes de que el ADN eucarionte pueda ser clonado dentro de células eucariontes, debe aislarse el ARNm eucarionte y usarse este para hacer ADN sin intrones. El enzima transcriptasa inversa -obtenida de ciertos virus- se utiliza para formar a partir de ARNm purificado de una célula eucarionte en ADN de doble cadena. El ADN así resultante, llamado ADN complementario o ADNc, puede ser entonces clonado dentro de células procariontes pues pueden ser transcritos y traducidos por la maquinaria de la célula bacteriana.

Técnicas de la ingeniería genética 02: separar fregmentos de ADN y localizar un gen

PREGUNTAS PARA COMPRENDER VIDEOS Y ANIMACIONES 2

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Hola chicos, soy el profesor Jean. Este es mi amigo y está triste porque es diabético y necesita insulina para estar sano y contento. Hoy vamos a fabricar insulina a través de organismos modificados genéticamente. Un organismo es cualquier ser vivo como yo, tú, un árbol y también las flores; una roca no lo es. Todos los organismos están formados por células. Esta es una célula como las que puedes encontrar en un animal como los seres humanos. En la célula hay ADN y el ADN es la causa de tu identidad: produce las características que tienes como el color de ojos; aquí está el gen para el color de ojos. Tu ADN también determina tu color de pelo; este es el gen para tu color de pelo en tu ADN. Otra característica que determina tu ADN es tu altura; este es el gen de la altura.

Un organismo está genéticamente modificado cuando sus genes han sido cambiados. También hay un gen en tu ADN que fabrica insulina....

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A lo largo de los últimos 30 años se han desarrollado muchas técnicas para detectar, copiar y secuenciar ADN. Estas técnicas suponen importantes avances tecnológicos, como el rápido progreso en la identificaciónde genes asociados con enfermedades y el estudio a gran escala del genoma humano completo.

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Dado que proteínas y los ácidos nucleicos son grandes moléculas con muchos grupos químicos cargados, cada molécula tiene una carga neta diferente -los ácidos nucleicos tienen carga negativa-; esta característica puede usarse para separalos. El dispositivo usado para hacer esto está formado por dos láminas de plástico o vidrio con un hueco entre ellas; se rellena este hueco con una gelatina de modo que haya varios pocillos para las muestras en la parte superior. En la parte inferior hay un electrodo (el positivo) y un depósito para el buffer (sustancia que mantiene estable el pH, detalle importante para el mantenimiento estable de las cargas elécticas en las moléculas); en la parte superior otro reservorio para buffer y el electrodo negativo. Se añaden las muestras a analizar se añaden a los pocillos superiores. Habitualmente en uno de los pocillos se coloca una mezcla de moléculas de tamaño conocido llamada standards con las cuales comparar las moléculas de tamaño desconocido (a medida que se vayan separando)

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Empieza el video repitiendo ideas del video anteror... La novedad a partir del minuto 1:10 está en la extracción de los fragmentos de ADN separados por electroforesis fuera de la gelatina que sirvió como soporte: esa es la técnica Southern Blot: el ADN se transfiere desde la gelatina electroforética a una membrana de nylon, algo que sucede debido a capilaridad desde la gelatina inferior hasta el nylon sobre ella, ayudado por la succión que producen las toallitas absorbentes. Antes se dasnaturalizó el ADN con el pH adecuado, lo que quiere decir que se consiguió que sus las dos semicadenas de cada fragmento en el gel se separen. Ahora entendemos el sentido de la desnaturalización: se emplea una sonda para localizar el gen buscado. La sonda es un pequeño trocito de ADN o ARN monocatenario y radiactivo_-para hacerlo visible- de secuencia conocida y con la cual vamos a localizar el gen buscado. Así por ejemplo, si sé que la insulina tiene la secuencia de aminoácidos Pro-Pro-Leu-Val..., fabrico el ARN relacionado con ella y puedo utilizar este ARN de 12 nucleótidos -con algún elemento radictivo en su composición- para localizar el gen de la insulina dentro de todo el conjunto: lo uso como sonda

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En la hibridación Southern, sondas -o probes- hibridan con el ADN que está situado en determinadas posiciones de un filtro -la membrana de nylon que antes decíamos-. Los fragmentos de ADN se han separado con anterioridad mediante una electroforesis en gel, luego han sido desnaturalizados en el gel y más tarde han sido transferidos al filtro por acción de la capilaridad: una solución salina migra desde la esponja empapada situada bajo la gelatina y a través del gel hasta el filtro, transportando las moléculas de ADN desde el gel hasta el filtro.

Se coloca el filtro en una bolsa, con sondas marcadas (labelled probes) para permitir que suceda la hibridación. Lavando el filtro, se retiran las sondas en exceso que no se han unido específicamente con el ADN del filtro. La radiación emitida por las sondas marcadas -recuerda que son sintéticas y contenían algunos átomos radiactivos- produce bandas negras en una película de rayos X. La comparación entre la posición de las sondas unidas al filtro con una foto del gel original permite identificar el/los ADN complementario/os a la/las sonda/as

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La técnica Southern Blot (mancha de Southern) se utiliza para verificar la presencia o ausencia de una secuencia de nucleótidos específica en el ADN de distintas fuentes y para identificar el tamaño de los fragmentos de restricción que contienen la secuencia.

En este procedimiento, el ADN es aislado de cada fuente, y digerido con una enzima de restricción específica.

Los fragmentos de restricción de ADN son cargados en un gel de agarosa y los fragmentos son separados por electroforesis según su tamaño. Los fragmentos más pequeños migran más rápido que los grandes.

El ADN es transferido del gel frágil a un filtro de nylon.

Luego se añade la sonda de ácido nucleico marcado radiactivamente. La sonda se une a los segmentos de ADN complementarios. Observa que el segmento de ADN que está siendo buscado no esta presente en el organismo B.

Para detectar la posición de la sonda radiactiva, la membrana de nylon se cubre con una película de rayos-X. Después del revelado, las posiciones de la sonda se hacen visibles.

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A menudo se requiere detectar un cierto fragmento de ADN o ARN de nuestro interés dentro de una mezcla de muchos fragmentos con secuencias diferentes. Una manera de hacerlo es mediante la hibridación. El término hibridación se refiere al proceso en el cual dos fragmentos complementarios de ADN o uno de ADN y otro de ARN se unen para formar una molécula de dos semicadenas. El fragmento de ADN o ARN usado para detectar secuencias complementarias se denomina "probe" (sonda). Si la sonda está marcada por ser radiactivo o fluorescente, los fragmentos de ADN o ARN con los que hibrida resultan marcados y pueden ser detectados. Antes de realizarse la hibridación, la doble cadena de ADN debe separarse en semicadenas sencillas (desnaturalizarse); la desnaturalización se consigue calentando la muestra. Entonces las semicadenas sencillas podrán hibridar con semicadenas sencillas complementarias que haya en el entorno, incluídas las de las sondas marcadas.

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Perfil genético o huella genética.

- ¿Qué es la huella genética? Es una técnica utilizada por los científicos para distinguir entre individuoas de la misma especie, usando muestras de ADN.

- ¿Quién inventó la técnica? Alec Jeffreys, en la Universidad de Leicester en 1985. Recibió el título honorífico de "Sir" en 1994

- Etapas del proceso de obtención de la huella genética:

a) Se rompen las células para liberar el ADN. Si sólo se dispone de una pequeña cantidad de ADN, debe ser amplificado usando la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR explicada en una entrada posterior)

b) El ADN es fragmentado usando enzimas de restricción. Cada enzima de restricción corta el ADN en una secuencia específica de bases. Los segmentos de ADN resultantes son llamados "fragmentos de restricción". Esta etapa proporciona cientos de fragmentos de restricción de diferentes tamaños porque las secuencias de bases cortadas pueden estar distantes (originando fragmentos largos) o cercanas (originando fragmentos cortos)

c) Los fragmentos se separan en base a su tamaño usando el procedimiento llamado "electroforesis de gel". Los gragmentos de ADN son inyectados en los pocillos y se aplica una corriente eléctica al gel. Como el ADN está negativamante cargado, es atraído por el extremo positivo del gel; los fragmentos de ADN más cortos se mueven más rápido que los fragmentos largos. Se añade un material radiactivo que se combina con los fragmentos de ADN produciendo una imagen fluorescente. Así se obtiene la copia fotográfica de las bandas de ADN.

d) Es entonces cuando se puede analizar el patrón de distribución de los fragmentos. La huella genética es utilizada por los forenses para resolver crímenes y problemas médicos:  el perfil genético de cada individuo es altamente específico; la probabilidad de que dos personas tengan exactamente el mismo prfil genético es de 1/30.000 millones (hay alrededor de 7.000 millones de habitantes en a tierra) salvo para los gemelos univitelinos.

* Materiales biológicos usados para tomar muestras: sangre, pelo, saliva, semen, tejidos celulares, restos de células vaginales en el exterior de un condón...

* Protocolo para resolver delitos:

- Se comparan el modelo de perfil genético de víctima y sospechoso. Si el perfil genético coincide con el del sospechoso, existe una fuerte prueba de que el sospechoso estuvo presente en la escena del delito (aunque no prueba que lo cometiera). Si el perfil genético del sospechoso no encaja, el sospechoso debe ser eliminado de la investigación.

- Ejemplo: se ha cometido un asesinato; el equipo forense rcoge muestras de sangre de la escena del crimen. Se prepara el perfil genético de la muestra de sangre, de la víctima y del sospechoso. En la imagen ves que la muestra de sangre corresponde al sospechoso, que este estuvo, por tanto, en la escena del crimen.

* Resolución de problemas médicos: la técnica puede ser usada para determinar si una persona en concreto es el padre/madre de un niño en casos relativos a paternidad, herencia, inmigración...

- Ejemplo de un test de paternidad: comparando el perfil genético de la madre y del niño es posible identificar fragmentos en el niño que están ausentes en la madre y que por lo tanto han sido heredados del padre biológico. Date cuenta que tanto la madre como el padre sólo transmiten un cromosoma de cada pareja de homólogos al hijo, por lo que NO TODAS LAS SECUENCIAS maternas están en el hijo ni todas las secuencias paternas están en el hijo. En el ejemplo el hombre es el padre biológico del nino puesto que las secuencias que el niño no tiene de la madre coinciden con secuencias del hombre.

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Las enzimas de restricción reconocen secuencias de nucleótidos muy específicas en el ADN.

Los ADNs de diferentes individuos raramente tienen el mismo orden de sitios de restriccion y distancias entre estos sitios. Por lo tanto, se dice que la población es polimórfica (tiene diferentes formas) para estos patrones de fragmentos de restricción.

Estas diferencias se denominan polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLPs). Diferencias así aparecen por mutaciones.

Cortando una muestra de ADN con una enzima de restricción concreta se obtienen fragmentos de ADN de diferente longitud. Estos fragmentos se separan por electroforésis en gel. Así resulta un patrón de bandas que es único para el organismo analizado. Esta "huella genética" es usada por los forenses durante una investigación criminal. RFLPs también es útil como marcadores para identificar un grupo concreto de gente con riego de padecer ciertos problemas de origen genéticos.