Técnicas de la ingeniería genética 01

• Técnicas de ingeniería genética, por Lourdes Luengo del IES La Rábida (Huelva)
• Las ideas pincipales

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PREGUNTAS PARA COMPRENDER LOS VÍDEOS Y ANIMACIONES



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Las ENZIMAS DE RESTRICCIÓN son enzimas que cortan el ADN en secuencias específicas de nucleótidos, La secuencia reconocida tiene normalmente una longitud de cuatro a seis nucleótidos. Por ejemplo la enzima de restricción EcoR1 reconoce la secuencia GAATTC. Las dos semicadenas de ADN tienen la misma secuencia reconocible pero en sentidos opuestos. Puesto que la secuencia de reconocimiento está presente en ambas semicadenas, la endonucleasa de restricción puede unirse y cortar ambas semicadenas. Como el punto de corte frecuentemente no está en el centro de la secuencia de reconocimiento las cadenas de ADN son antiaparalelas los extremos del corte no coinciden a la misma altura; después del corte cada semicadena de ADN tiene un extemo como semicadena sencilla de unos pocos nucleótidos y ambos extremos son complementarios entre sí; es a lo que se llama "extemos cohesivos o pegajosos" LO QUE HACE A LOS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN TAN VALIOSOS ES QUE SIEMPRE CORTAN IGUAL Y LOS FRAGMENTOS PRODUCIDOS POR UNA CIERTA ENZIMA -procedentes, por ejemplo, de dos células distintas- PUEDEN UNIRSE ENTRE SÍ. SON HERRAMIENTAS FUNDAMENTALES EN LA INGENIERÍA GENÉTICA

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El primer paso para clonar un gen (clonar = copiarlo numerosas veces dentro de otro organismo) es aislar el gen deseado desde el organismo que lo contiene.

El ADN se aisla y después se fragmenta con enzimas de restricción. Los enzimas de restricción que se usan en clonación producen cortes en secuencias específicas del ADN, generando fragmentos con extremos cohesivos o pegajosos. Cada fragmento tiene una secuencia de nucleótidos de cadena sencilla en sus extremos que es capaz de hibridar con ADN que haya sido fragmentado con el mismo enzima de restricción. Los fragmentos de ADN se incorporan entonces a plásmidos. Los tipos de plásmidos usados en clonación tienen un único sitio de corte para el enzima de restricción y cuando es cortado por el enzima de restricción genera el mismo tipo de extremos cohesivos que hay en los fragmentos de ADN que van a ser clonados. Los extemos cohesivos del plásmido y del fragmento de ADN a clonar se aproximan y el enzima ligasa produce la unión definitiva. El siguiente paso es incorporar el plásmido a bacterias hospedadoras (es la trasnformación bacteriana y espontáneamente las bacterias absorben plásmidos libres que haya en su entorno). Cada célula contiene un fragmento diferente del ADN original del organismo. Todos estos tipos bacterianos representan en conjunto una biblioteca de ADN. Las células pueden ser, ahora, sembradas sobre un medio se cultivo gelatinoso (agar). La colonia de células que contiene el ADN deseado debe ser ahora identificada y aislada.

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Uno de los primeros experimentos en ingeniería genética fue dirigido por Stanley Cohen y Herbert Boyer en 1973. Demostraron que el gen del ARN ribosómico de rana podía ser transferido y expresarse en células bacterianas. El primer paso fue construir el plásmido vector llamado pSC101. Este vector artificial contenía un único lugar para el enzima de restricción EcoR1 y un gen para la resistencia al antibiótico tetraciclina.

Se utilizó el enzima de restricción EcoR1 para cortar el ADN de la rana en pequeños fragmentos. Después los fragmentos de ADN se mezclaron con el plásmido vector que había sido cortado con el mismo enzima de restricción EcoR1. Los extremos pegajosos o cohesivos del ADN se asocian y se unen gracias a la ADN ligasa. Algunos plásmidos incorporan otros genes de la rana distintos del gen para ARNr y algunos plásmidos ni siquiera incorporan fragmentos de ADN de la rana. Los plásmidos son transferidos a una raza -cepa- de bacteria Escherichia coli sensible a la tetraciclina y estas bacterias son sembradas en un medio de cultivo que contiene tetraciclina. Las células que han incorporado el plásmido portador del gen de la tetraciclina crecen y forman colonias de celulas. Algunas de esas colonias están formadas por células que portan el gen del ARNr de la rana. Los investigadores comprueban la presencia del gen del ARNr de la rana en las colonias que han crecido

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Hay diversas maneras de fabricar vacunas. Tradicionalmente, las vacunas han consistido en patógenos muertos o inactivos. Un segundo enfoque tradicional es usar una cepa (variante) atenuada del patógeno. Durante la atenuación, el patógeno pierde su virulencia, pero retiene muchos de sus antígenos y asi es capaz de provocar una respuesta inmune.

Las vacunas de subunidades o acelulares consisten en componentes seleccionados del patógeno como por ejemplo una estructura superfical, una macromolécula interna o el flagelo. -Son más seguras puesto que no se utiliza el organismo completo y por lo tanto no hay riesgo de una defectuosa atenuación-

Las vacunas recombinantes estan producidas mediante la clonacion dentro de un microrganismo hospedador del gen de una estructura como por ejemplo una proteína de superficie de un patógeno. Por ejemplo, el gen de la proteina superficial del virus de la hepatitis B ha sido clonado en una célula de levadura. La levadura produce la proteína superficial del virus la cual puede ser purificada del medio de cultivo de la levadura y usada como una vacuna.

Ya hemos comentado sobre una dificultad que se presenta al intentar clonar un gen de células eucariontes dentro de una bacteria debido a la presencia de intrones en los genes eucariontes. 

En la mayoría de los eucariotas, los segmentos que se expresan en los genes están separados por secuencias intercaladas de nucleótidos llamadas intrones. Los intrones y los exones son transcritos por la ARN polimerasa dando lugar a un ARN mensajero inmaduro o precursor del ARNm definitivo. Después los intrones son eliminados del presursor del ARNm y los exones se unen para formar el ARNm maduro. 

El ADN de las células procariotas no contiene intrones y por lo tanto las bacterias son incapaces de eliminar los intrones del ADN eucarionte y producir ARNm funcional. Por lo tanto el ADN eucarionte no puede ser clonado directamente en células procariontes para hacer proteínas eucariontes funcionales. 

Antes de que el ADN eucarionte pueda ser clonado dentro de células eucariontes, debe aislarse el ARNm eucarionte y usarse este para hacer ADN sin intrones. El enzima transcriptasa inversa -obtenida de ciertos virus- se utiliza para formar a partir de ARNm purificado de una célula eucarionte en ADN de doble cadena. El ADN así resultante, llamado ADN complementario o ADNc, puede ser entonces clonado dentro de células procariontes pues pueden ser transcritos y traducidos por la maquinaria de la célula bacteriana.