domingo, 3 de abril de 2011

Técnicas de la ingeniería genética 03: secuenciar el ADN


La secuenciación de ADN se basa en las diferencias químicas entre desoxirribonucleóticos normales y didesoxirribonucleótidos. Los desoxirribonucleótidos (naturales, normales) contienen contienen un grupo hidroxilo OH en la posición llamada 3 del anillo del azúcar (de la desoxirribosa) y la ADNpolimerasa (en enzima que fabrica ADN) puede añadir el siguiente nucleótido al extremo OH. Se puede incorporar un didesoxirribonucleólido al extremo de la cadena en crecimiento pero no contiene el grupo OH en la posición 3 por lo que tras él no se puede incorporar un nucleótido posterior. La incorporación de didesoxirribonucleótidos a la cadena paraliza la síntesis de ADN.
El ADN a secuenciar es desnaturalizado en un tubo de ensayo; la mezcla de reacción contiene
    * el primer complementario a la semicadena molde -entiéndelo como un cebo de unos pocos nucleótidos ya encadenados necesario y sin el cual no comienza el alargamiento,
    * la ADN polimerasa,
    * los cuatro desoxirribonucleótidos naturales normales y
    * un tipo de didesoxirribonucleótido que además está marcado, en este caso didesoxiA. El didesoxiA está presente a una concentración menor que su análogo normal desoxiA.

   1. El primer se empareja con la secuencia complementaria y la síntesis de ADN comienza.
   2. Cuando el didesoxi es insertado a la cadena en formación, la síntesis de la cadena de la que forma parte se detiene.
   3. Optimizando la concentración de los didesoxiA y los desoxiA se forman cadenas cuyo alargamiento cesa en cada una de las A.
   4. Los fragmentos resultantes son separados por electroforésis en gel y el marcador de los didesoxirribonucleotidos permite visualizarlos.

Se repite este procedimiento con los cuatro didesoxirribonucleótidos y si cada uno de los cuatro tipos de didesoxirrib tiene una etiqueta fluorescente diferente, las cuatro reacciones se pueden desarrollar en el mismo tubo. Cuando los productos de reacción son separados debería haber fragmento marcados de todas las longitudes en cuanto al número de bases con los cuatro tipos de bases reconocibles por cuatro etiquetas reconocibles.

    * En la elecroforesis de la imagen final se han encontrado fragmentos de una sola base C -tras el primer- correspondiente al didesoxirrC marcado con una etiqueta fluorescente azul que no se ha podido alargar más por ser uno de los nucleótidos trucados;
    * se ha encontrado un fragmento de 2 bases que acaba en el didesoxiT naranja trucado;
    * se ha encontrado un fragmento de 3 bases que acaba en didesA con etiqueta roja...

Luego la secuencia de la cadena en formación es CTA...
INGENIOSO MÉTODO... UN POCO LIOSO HASTA QUE ENTIENDES EL FUNDAMENTO, PERO PARA ESO ESTOY YO. ADEMÁS LO VES EN OTROS VIDEOS



¿Entiendes que la secuencia averiguada desde la imagen final da como resultado GTATAGCACGCT?



Una vez que un trozo de ADN se ha ampliado, puede ser secuenciado. En este proceso, se establecen cuatro mezclas de reacción, cada uno incluyendo:
1. ADN a secuenciar
2. ADN polimerasa
3. Una fuente de nucleótidos (Adenina, Citosina, Guanina y Timina)
4. Una pequeña cantidad de la cadena de terminación de la variante de uno de los cuatro nucleótidos.
La enzima ADN polimerasa incorpora una variante de la cadena de terminación de forma aleatoria, con el tiempo se pondra fin a la cadena de nucleótidos de cada posición -posible en unos pocos cientos de bases-.
Los productos de las mezclas de reacción se ejecutan en un gel de electrofóresis, donde se encuentra la secuencia deducida por la lectura,- desde la pieza más pequeña a la más grande-.
Si las etiquetas de diferentes fluorescentes se utilizan para las bases de la variante, la secuencia se puede hacer toda en una sola reacción, las bandas pueden ser detectadas y la secuencia de lectura automática. Todo el proceso de preparación de muestras de ADN y la secuencia está ahora altamente automatizada, un desarrollo que ha sido esencial para la realización rentable y oportuna del proyecto genoma humano.




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